细胞色素C是一类含有铁啉基团的电子传递蛋白，只存在于需氧细胞中。细胞色素在线粒体内膜上起传递电子的作用。细胞色素C是细胞色素一种。它在线粒体呼吸链上位于细胞色素B 和细胞色素氧化酶之间，是呼吸链的一个重要组成部分。每分子细胞色素C含有一个血红素和一条多肽链。现已从许多来源获得细胞色素C结晶，并已对100多种细胞色素C蛋白的一级结构进行了测定。
细胞色素C 是以一种铁卟啉为辅基的呼吸酶，广泛存在于所有的需氧组织中。在心肌与其他做剧烈运动的肌肉中含量zui为丰富。细胞色素C 位于线粒体的蛋白质—脂质络合物中，分子量约为13000，肽链中含有19个赖氨酸残基，为一碱性蛋白, 等电点（10.5~10.8）高、易溶于酸性溶液, 故采用酸化水提取。人造沸石为铝酸钠，它是一种阳离子交换剂，细胞色素C分子刚好进入它的表面空隙。在pH7.5时细胞色素C 呈正电荷，它可与沸石分子上的钠离子发生交换，从而被沸石吸附。装入层析柱后，用25%硫酸铵洗脱，又可将细胞色素C 交换下来。硫酸铵主要是降低沸石对细胞色素C 的亲和力。硫酸铵盐析可明显提高细胞色素C 纯度，主要为去除杂蛋白。另外三氯乙酸可引起细胞色素C 变性和聚合，必须严格控制三氯乙酸用量。
细胞色素C与材料试剂
1、 设备：组织捣碎机、酸度计、离心机、分光光度计、层析柱、透析袋、磁力搅拌器、冰箱。
2、 仪器：剪刀、烧杯、漏斗、滤纸、天平、玻璃棒、纱布、试管、胶头滴管。
3、 试剂：联二亚硫酸钠、硫酸、硫酸铵、三氯乙酸、人造沸石、氯化钡、氯化钠、氢氧化铵。
4、 材料：新鲜猪心（2个）。
细胞色素C实验步骤
1、预处理：健康猪心去脂肪等结缔组织—→剪碎放入碎冰中（保护酶的活性，避免捣碎机破碎时使酶失活）—→放入生理盐水中清洗去污—→称重：烧杯80g ，烧杯＋猪心=240g，（240-80）×1.5=240ml酸化水—→组织捣碎机匀浆10min （匀浆3min ，停5min ，为了保证捣碎机安全）
2、提取：搅拌后静置2h —→四层纱布过滤后加入1.5倍酸化水于沉淀物中，在过滤后静置2h —→放入冰箱保存过夜—→从冰箱中取出—→加2mol/L氨水调PH 至6.0，静置30min ，过滤—→滤液加2mol/L氨水调PH 至7.5，静置30min, 过滤
3、吸附：加10%人造沸石（滤液为220ml ）—→磁力搅拌器搅拌吸附1h —→蒸馏水洗3次—→0.2%NaCI 溶液洗3次—→滤出人造沸石待用
4、洗脱：在柱中装人造沸石体积的三分之二蒸馏水—→将沸石放入柱中—→装满25%硫酸铵溶液进行洗脱，流速控制在2ml/min 以下, 收集红色的洗脱液（没分辨出红色液体阶段，收集了所有洗脱液）
5、盐析：在洗脱液（300ml ）中慢慢加入固体硫酸铵75g, 边加边搅拌，使硫酸铵溶液的浓度为50%—→置4℃冰箱过夜—→过滤，收集滤液—→向过滤液中按22ml/L的量滴加浓度为20%的三氯乙酸溶液（过滤液和20%三氯乙酸溶液在4℃遇冷, 边加边搅拌, 加时要快, 防止局部蛋白质变性）—→加完后分成8管，立即离心—→无明显沉淀，再5000转离心15min —→无明显沉淀，向每只离心管加入2滴浓度为20%的三氯乙酸溶液—→再5000转离心15min —→无明显沉淀，实验结束
6、透析 将上述溶解后的细胞色素C 装入透析袋中, 放进500ml 烧杯中（用磁力搅拌器搅拌），用去离子水透析, 除去硫酸根离子，15min 换水一次，换手3~4次后，检查硫酸根离子是否已被除尽。检查方法：取2ml 氯化钡溶液加入试管中，滴加2~3滴透析外液至试管中，若出现白色沉淀，表示硫酸根离子未除尽，如果不出现沉淀，表示透析*。将透析液过滤， 收集滤液即为细胞色素C 粗品。 记录此粗品的体积。
实验目的：
1、通过细胞色素C的制备，了解制备蛋白质制品的一般原理和步骤
2、掌握制备细胞色素C的操作技术及含量的测定方法
实验原理：
细胞色素是一类含有铁啉基团的电子传递蛋白，只存在于需氧细胞中。细胞色素在线粒体内膜上起传递电子的作用。细胞色素C是细胞色素一种。它在线粒体呼吸链上位于细胞色素B和细胞色素氧化酶之间，是呼吸链的一个重要组成部分。每分子细胞色素C含有一个血红素和一条多肽链。现已从许多来源获得细胞色素C结晶，并已对100多种细胞色素C蛋白的一级结构进行了测定。
结果表明，细胞色素C的氨基酸残基的数目在103~113之间；不同来源细胞色素C的的氨基酸残基的顺序及含量都有一定的差异。细胞色素C中赖氨酸含量较高，等电点为10.7，含铁量为0.38%~0.43%，Mr为12000~13000，猪心细胞色素C分子量12200。细胞色素C是一种稳定的可溶性蛋白，它易溶于水及酸性溶液，故常用酸性水提取。
细胞色素C分为氧化型和还原型两种，氧化型水溶液呈深红色，还原型水溶液呈桃红色。细胞色素C对热比较稳定，不易变性。pH 7.2~10.2，100℃加热3分钟，细胞色素C氧化型和还原型变性程度均为18%~28%，若增加加热时间，氧化型的不可逆变性程度比还原型的为高。细胞色素C对酸碱也较稳定，可抵抗0 .3mol/L氢氧化钾溶液的长时间处理。一般都将细胞色素C制成还原型的，因为比较稳定并易于保存。
细胞色素C 是以一种铁卟啉为辅基的呼吸酶，广泛存在于所有的需氧组织中。在心肌与其他做剧烈运动的肌肉中含量zui为丰富。细胞色素C 位于线粒体的蛋白质—脂质络合物中，分子量约为13000，肽链中含有19个赖氨酸残基，为一碱性蛋白, 等电点（10.5~10.8）高、易溶于酸性溶液, 故采用酸化水提取。人造沸石为铝酸钠，它是一种阳离子交换剂，细胞色素C 分子刚好进入它的表面空隙。在pH7.5时细胞色素C 呈正电荷，它可与沸石分子上的钠离子发生交换，从而被沸石吸附。装入层析柱后，用25%硫酸铵洗脱，又可将细胞色素C 交换下来。硫酸铵主要是降低沸石对细胞色素C 的亲和力。硫酸铵盐析可明显提高细胞色素C 纯度，主要为去除杂蛋白。另外乙酸可引起细胞色素C 变性和聚合，必须严格控制酸用量。
细胞色素C与材料试剂
1、 设备：组织捣碎机、酸度计、离心机、分光光度计、层析柱、透析袋、磁力搅拌器、冰箱。
2、 仪器：剪刀、烧杯、漏斗、滤纸、天平、玻璃棒、纱布、试管、胶头滴管。
3、 试剂：联二亚硫酸钠、硫酸、硫酸铵、、人造沸石、氢氧化铵。
4、 材料：新鲜猪心（2个）。
结果表明，细胞色素C的氨基酸残基的数目在103~113之间；不同来源细胞色素C的的氨基酸残基的顺序及含量都有一定的差异。细胞色素C中赖氨酸含量较高，等电点为10.7，含铁量为0.38%~0.43%，Mr为12000~13000，猪心细胞色素C分子量12200。细胞色素C是一种稳定的可溶性蛋白，它易溶于水及酸性溶液，故常用酸性水提取。细胞色素C分为氧化型和还原型两种，氧化型水溶液呈深红色，还原型水溶液呈桃红色。细胞色素C对热比较稳定，不易变性。pH 7.2~10.2, 100℃加热3分钟，细胞色素C氧化型和还原型变性程度均为18%~28%，若增加加热时间，氧化型的不可逆变性程度比还原型的为高。细胞色素C对酸碱也较稳定，可抵抗0 .3mol/L氢氧化钾溶液的长时间处理。一般都将细胞色素C制成还原型的，因为比较稳定并易于保存。
细胞色素C不是根据辅基来命名；与其他三类细胞色素非共价结合血红素不同的是，细胞色素c通过分子中的半胱氨酸巯基与血红素共价结合。细胞色素e尚无，但有细胞色素f（细胞色素c中的一种）。[3]此外，细胞色素d仅存在于细菌中。
扫一扫，关注微信
当前位置：